Measurement of the Translational Diffusion Coefficient and Hydrodynamic Radius of Proteins by Dynamic Light Scattering

Abstract

Diffusion is a fundamental process in biological systems that governs the molecular collisions driving biochemical reactions and membrane and transport. Measurement of the diffusion coefficient and application of the Stokes-Einstein equation produces the hydrodynamic radius, which is a commonly used gauge of particle size. Additionally, measurement of the diffusion coefficient and the sedimentation coefficient, and application of the Svedberg equation, yields the molecular weight, which is particularly useful in the characterization of very large macromolecules. Dynamic light scattering (DLS) is the most common method to measure the diffusion coefficient of macromolecules. We describe a procedure to perform DLS measurements on monomeric bovine serum albumin (BSA) purified by size-exclusion chromatography using the Zetasizer Nano S particle size analyzer. We compare several analytical methods in existing software programs to estimate the diffusion coefficient of BSA (extrapolated to water at 20°C at infinite dilution, ) and describe a statistical method to obtain 95% confidence limits of the precision of the estimates. We compare estimates to literature values obtained by diffusiometry, sedimentation velocity analytical ultracentrifugation, and other DLS instruments. The method of cumulant analysis in the program SEDFIT (www.analyticalultracentrifugation.com) produced the most precise estimate, 6.06 ± 0.07 F (1 F = 10-7 cm2 s-1), which was within the range of estimates obtained by diffusiometry or sedimentation velocity. This protocol is useful for DLS method validation and quality control., [抽象的] 扩散是生物系统中的一个基本过程，它控制着驱动生化反应、膜和运输的分子碰撞。扩散系数的测量和 Stokes-Einstein 方程的应用会产生流体动力学半径，这是一种常用的粒度度量。此外，扩散系数和沉降系数的测量以及 Svedberg 方程的应用可得出分子量，这在表征非常大的大分子时特别有用。动态光散射 (DLS) 是测量大分子扩散系数的最常用方法。我们描述了对使用 Zetasizer Nano S 粒度分析仪通过尺寸排阻色谱法纯化的单体牛血清白蛋白 (BSA) 进行 DLS 测量的程序。我们比较了现有软件程序中的几种分析方法来估计 BSA 的扩散系数（外推到 20°C 下无限稀释的水，) 并描述一种统计方法，以获得估计精度的 95% 置信限。我们将估计值与通过扩散测定法、沉降速度分析超速离心法和其他 DLS 仪器获得的文献值进行比较。SEDFIT ( www.analyticalultracentrifugation.com )程序中的累积量分析方法产生了最精确的估计值，6.06 ± 0.07 F (1 F = 10 -7 cm 2 s -1 )，它在扩散测量法获得的估计值范围内或沉降速度。该协议可用于 DLS 方法验证和质量控制。 [背景] 扩散是溶质浓度差异自发地向均匀状态降低的过程。它是生物系统中的一个基本过程，它控制着驱动生化反应和细胞内运输的分子碰撞（Berg，1983）。严格来说，与粒子的旋转扩散相反，这个过程称为平移扩散。描述的一维扩散的经验法则是由菲克在19描述的日世纪，其中指出，颗粒的流动速率正比于在给定的位置上的浓度梯度。比例常数被称为扩散系数，d 。 爱因斯坦在 1905 年开始的一系列论文中对扩散进行了分子解释（Einstein, 1926 [English translation first]）。爱因斯坦提出，溶质粒子因与溶剂粒子碰撞而受到力，溶剂粒子因热能而进行随机布朗运动。被碰撞力加速的粒子会受到与粒子速度成正比的阻力。称为摩擦系数f的比例常数是颗粒大小和形状的函数。爱因斯坦的扩散定律是 其中k是玻尔兹曼常数，T是绝对温度。这个方程是理解大分子流体动力学特性的基础。重要的是要注意，它仅限于稀释溶液中的双组分系统，例如，溶质分子和溶剂水。在三组分系统（例如，大分子、低分子量电解质和水）中，有四个扩散系数，组分 2 和 3 在没有另一个和两个交叉扩散系数的情况下各有一个（坦福德，1961 年）。在大多数动态光散射 (DLS) 研究中，测量是在所谓的伪二元条件下进行的，即在含有足够高浓度电解质以筛选大分子电荷的溶液中的低大分子浓度下进行。在这些条件下，交叉扩散项被认为可以忽略不计。对于半径为R的球形粒子，斯托克斯定律为 其中η是溶剂粘度。结合爱因斯坦方程，如果在已知温度和粘度的溶液中测量其扩散系数，则可以计算出球形粒子的半径 对于具有任意形状的粒子，流体动力学半径R h （也称为斯托克斯半径）可以使用斯托克斯-爱因斯坦方程计算 粒子的流体动力学半径是一个抽象概念，定义为假设的球形粒子的半径，其扩散系数与所考虑的实际粒子的扩散系数相同。重要的是要认识到，基于扩散系数和 Stokes-Einstein 方程的非球形粒子的“粒子大小”并不涉及粒子的任何实际几何特性。与扩散系数的单位（在 cgs 系统中为 cm 2 s -1 ）相比，R h因其长度单位的直观吸引力而被广泛使用。此外，因为温度和粘度是方程的组成部分。4如果粒子在这些参数的相关范围内没有发生结构变化，则R h与温度和粘度无关。遵循相同的警告，使用以下方法将扩散系数调整到溶剂水中 20°C 的标准条件 其中T和T 20分别是绝对实验温度和 20°C 时的温度，η和η 20,w是相应的溶剂粘度（Tanford，1961）。 粒子（包括大分子）的扩散测量最初是通过测量浓度梯度进行的 (Miller, 2014)。在自由扩散中，在一维扩散池中，含有颗粒的溶液和纯溶剂之间会形成一个尖锐的边界，通过光学方法在池中的各个位置测量浓度梯度。最准确的测量是使用 Gouy 干涉测量法和瑞利干涉测量法（Annunziata等人，2005 年；Miller，2014 年）进行的，它们在准确度和精密度方面是无与伦比的。虽然概念上很简单，但自由扩散测量在实践中要求极高，因为必须小心避免对流混合、采用的专用光学器件以及用于解释干涉图的分析方法。此外，扩散相对较慢，必须允许进行数小时到数天才能达到合适的浓度梯度，这限制了吞吐量。 相比之下，DLS 的扩散测量很容易进行，但基础物理学在概念上更加困难。有关 DLS 的评论，请参阅参考资料（Finsy，1994；Stetefeld等，2016；Ogendal，2017）。定性地，光与非吸收性粒子相互作用并准弹性地（即，与入射光的波长几乎相同）在所有方向上散射。当被入射光子撞击时，漫射粒子可以向着或远离的方向移动。结果，散射光被多普勒频移到不同的频率，产生建设性和破坏性干涉以及波动的强度。波动的频率随着扩散速率的增加而增加，这是 DLS 方法的基本原理。 在某个任意初始时间之后的短时间内测量的散射光强度是初始强度的函数。这种关系会随着粒子随机移动而恶化，直到它们最终失去对初始位置的记忆。描述散射光强度随时间变化的函数关系称为自相关 (Berne and Pecora, 1976)，由强度自相关函数给出 其中I(t)和I(t+τ)是初始时间t和稍后时间τ之间的散射光强度，称为衰减时间。括号表示对许多初始时间取平均值。归一化强度自相关函数是由 DLS 仪器报告的无量纲量，定义为 扩散系数与散射电场有关，与散射强度无关，特别是与归一化场自相关函数有关，定义为 对于单分散系统，归一化场自相关函数为 其中Γ称为衰减率。对于相对于光的入射波长足够小的粒子，衰减率与扩散系数的关系为 其中q是散射矢量的幅度， 其中n是溶剂的折射率，λ是入射光的波长，θ是散射角。 因此，测量g 2 (τ) ，但需要g 1 (τ)来计算扩散系数。转换是使用 Siegert 关系完成的 由于导出的B等于 1，但由于噪声而在实验中发生变化并成为拟合参数。β称为相干因子，取决于实验几何形状，也是一个拟合参数。几个因素使g 2 (τ)衰减的解释复杂化。大分子溶液通常是多分散的，或者是内在的（例如，糖蛋白的微异质性），或者是由于杂质。此外，它们总是在盐和缓冲液存在下作为多组分系统进行研究。散射强度大约随着流体动力学半径的 6次方增加。因此，比感兴趣的粒子大的聚集体或其他杂质的存在可以支配 DLS 测量。最后，实验噪声是所有测量的一个特征，在解释 DLS 结果时尤其麻烦。 处理多分散性的最简单方法是假设一些有限数量的k散射大分子并将数据拟合为指数衰减的总和，从而产生归一化的场自相关函数， 虽然这在一些拟合程序中完成，但更习惯地假设衰减的连续分布G(Γ)由下式给出 将实验数据拟合到该积分的最广泛使用的方法是累积量分析（Koppel，1972）。累积量分析有多种方法。Frisken (2001) 引入的一种方法使用 Siegert 关系，产生一个函数，其中g 2 (τ)与τ衰减通过非线性最小二乘回归拟合： 这里，分布的均值（一阶矩）是 z 平均扩散系数（Koppel，1972），和c k 、m k和D k分别是物种k的总细胞浓度、质量和扩散系数。μ2 , μ 3 ... 是关于均值的二阶矩和三阶矩等。第二时刻产生多分散指数， 由于测量误差，即使是真正的单分散溶液也会产生μ 2的非零估计。小于 0.1 的多分散指数通常被用作单分散性的标准（Brautigam，2019）。由于与高阶矩相关的误差，很少做出超过μ 2 的有意义的估计（如果有的话）。 对于单分散系统，可以使用 Svedberg 方程获得大分子的摩尔质量M （以 g/mol 为单位的 cgs 单位，用于转换为以道尔顿为单位的分子量） 其中s和是大分子的沉降系数和部分比容，R是气体常数，ρ是溶剂密度（Cantor 和 Schimmel，1980）。对于多分散系统，沉降速度测量产生重均沉降系数s w 。的值小号瓦特，在20℃下和在无限稀释外推至溶剂水的条件下，是由测定的浓度依赖性估计小号瓦特和外推。扩散系数的对应值为。将这些值代入 Svedberg 方程可得出多分散体系的重均摩尔质量M w （Pusey等，1974）。 一些作者指出累积量分析仅适用于高斯分布函数，这是不正确的。其他作者指出累积量分析仅适用于单峰函数。这似乎也不正确。然而，从产生多模态的多分散系统得出的参数估计的效用是有限的。出于这个原因，另一种方法是尝试拟合数据以估计方程中积分中的函数G(Γ)。14，这是系统中所有散射粒子的分布。这个积分是在许多物理系统中出现的 Fredholm 积分的一个例子。它没有解析解，并且以数值求解是出了名的不适定。为了解决这个问题已经做出了相当大的努力，并且在 DLS 软件程序中可以使用各种方法来计算它。 “纳米材料”（定义为“尺寸”大约在 1 到 100 nm 之间的粒子（Bhattacharjee，2016）的多分散性的尺寸和表征已在许多商业领域中得到应用。因此，具有自动数据收集和分析功能的低成本 DLS 仪器已变得广泛可用。这在学术应用中既是福也是祸，因为非专业调查员可以获得高质量、易于获取的数据，但在智力上与基础技术和分析相去甚远。例如，本协议中描述的 Malvern Zetasizer Nano S 粒度分析仪甚至不报告扩散系数，而是报告流体动力学半径或直径。此外，与仪器相关的文档提供了关于仪器特性和实验结果分析方法的有限信息。 因此，正如现代实验室经常发生的情况一样，除了研究对象之外，DLS 测量还开辟了一个单独的额外研究项目，旨在了解仪器及其相关软件。在该协议中，描述了一种方法来验证商业 DLS 仪器，其目标是准确估计大分子扩散系数。选择牛血清白蛋白 (BSA) 作为参考材料，因为之前已经使用自由扩散（Creeth，1952 和 1958；Wagner 和 Scheraga，1956）和其他 DLS 仪器（Oh 和 Johnson，1981；Gaigalas）对其扩散系数进行了测量。等人，1992 年）。

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