Screening for Lysogen Activity in Therapeutically Relevant Bacteriophages
Fernando Gordillo, Jeremy J. Barr
Abstract
Lysogenic phages can integrate into their bacterial host’s genome, potentially transferring any genetic information they possess including virulence or resistance genes, and are therefore routinely excluded from therapeutic applications. Lysogenic behavior is typically seen in phages that create turbid plaques or possess subpar bactericidal activity; yet, these are not definitive indicators. As a result, the presence of integrase genes is often used as a hallmark for lysogenic behavior; however, the accuracy of genetic screening for lysogeny depends on the quality of the extraction, sequencing and assembly of the phage genome, and database comparison. The present protocol describes a simple phenotypic test that can be used to screen therapeutically relevant phages for lysogenic behavior. This test relies on the identification of spontaneous phage release from their lysogenized host and can be reliably used in cases where no sequencing data are available. The protocol does not require specialized equipment, is not work-intensive, and is broadly applicable to any phage with an easily culturable bacterial host, making it particularly amenable to settings with limited resources.Graphical abstract:Screening pipeline for lysogen activity of a given phage, [摘要]溶源性噬菌体可以集成到他们的细菌宿主的基因组中，有可能将任何遗传信息它们具有包括毒力或抗性基因，并且是第erefore从治疗应用常规排除。溶原行为通常见于创造混浊斑块或噬菌体具有欠佳的杀菌活性; 但是，这些并不是确定的指标。结果，整合酶基因的存在经常被用作溶原行为的标志。ħ H但是，遗传筛选的精度溶原 依赖于提取，排序的质量和组件噬菌体基因组，一个的第二数据库COMPAR ISON 。个E存在协议描述了一个简单的表型试验，可用于筛选治疗相关的噬菌体溶原性为行为。个是测试依赖于自发释放噬菌体的识别从它们的溶源化的宿主，并且可以在没有测序数据的情况下能够可靠地使用。该方案不需要专门的设备，不需要大量的劳动，并且广泛适用于具有易于培养的细菌宿主的任何噬菌体，使其特别适合于资源有限的环境。 图形摘要：小号creen ING管道的溶源的给定噬菌体的活动[背景]噬菌体疗法，所述的场是临床上使用的病毒来杀死细菌，已经生长成指数超过最近十年（戈迪略阿尔塔米拉诺和巴尔，2019） 。在选择其用于治疗用途之前，通常将噬菌体进行彻底的表征流水线处理（Terwilliger等，2020）。溶原性或温带型噬菌体是具有整合自身能力的宿主噬菌体，由于它们的杀菌能力低，同质免疫力的出现以及溶原性转化的潜在有害后果而被常规排除在治疗用途之外（Fortier和Sekulovic，2013 ；海曼（Hyman），2019年）。首先怀疑在细菌性草坪上产生混浊噬菌斑的噬菌体中存在温和的行为。但是，噬菌斑形态可能会因多种因素而有很大差异，包括使用的生长培养基和细菌宿主的生理状态（Ramesh et al。，2019）。细菌生长测定中延迟或不合标准的杀菌活性也可以用作指示剂，但其解释并不总是很明确。或者，对溶原性必不可少的基因（例如整合酶和切除酶）进行基因型筛选是温带行为的进一步指标（Hyman，2019）。然而，噬菌体基因组的提取和测序可能具有挑战性，基于同源性的分析的准确性高度依赖于测序数据，程序集和可用数据库的质量（Russell，2018）。重要的是，噬菌体基因组中预测的整合酶的存在可能不能肯定地证实在体外或体内裂解宿主的能力（Howard-Varona et al。，2017）。在这里，我们概述了从Pope等人修改而来的简单协议。（2013），其评估了给定噬菌体体外溶血其宿主的能力。在没有测序数据的情况下，该测定法可以可靠地使用。此外，该协议具有提供的优点确认对于给定的噬菌体，而不是溶原行为，预测，通过基因组sequenc给予荷兰国际集团系测试。它不需要专门的设备，并且可以补充对牙菌斑形态和生长的分析。虽然我们describ Ë协议使用的鲍曼不动杆菌-特异性噬菌体（戈迪略阿尔塔米拉诺等人，202。1 ），我们还提供数据的肠球菌，屎特异的噬菌体（图URE 1），这表明该方法广泛地适用于任何噬菌体，带有可在这种盖培养基上培养的细菌宿主。因此，可能需要调整孵育条件和培养基条件以适合宿主。最后，除了EXC泸定从治疗用途溶源性噬菌体，该协议可以用于产生细胞溶素原（细菌携带原噬菌体）用于噬菌体生物学和生物技术研究的下游应用。