Mechanical Fractionation of Cultured Neuronal Cells into Cell Body and Neurite Fractions
Ankita Arora, Raeann Goering, Hei‐Yong G. Lo, J. Matthew Taliaferro
Abstract
Many cells contain spatially defined subcellular regions that perform specialized tasks enabled by localized proteins. The subcellular distribution of these localized proteins is often facilitated by the subcellular localization of the RNA molecules that encode them. A key question in the study of this process of RNA localization is the characterization of the transcripts present at a given subcellular location. Historically, experiments aimed at answering this question have centered upon microscopy-based techniques that target one or a few transcripts at a time. However, more recently, the advent of high-throughput RNA sequencing has allowed the transcriptome-wide profiling of the RNA content of subcellular fractions. Here, we present a protocol for the isolation of cell body and neurite fractions from neuronal cells using mechanical fractionation and characterization of their RNA content.Graphic abstract:Fractionation of neuronal cells and analysis of subcellular RNA contents, [摘要]许多细胞包含在空间上定义的亚细胞区域，这些区域执行 由局部蛋白质实现的特殊任务。这些定位蛋白的亚细胞分布通常通过编码它们的RNA分子的亚细胞定位来促进。RNA定位过程研究中的一个关键问题是给定亚细胞位置上存在的转录本的特征。从历史上看，旨在回答这个问题的实验都集中在基于显微镜的技术上，该技术一次靶向一个或几个转录本。但是，最近，高通量RNA测序技术的出现允许对亚细胞级分的RNA内容进行转录组范围内的分析。在这里，我们使用机械分馏提出了一个协议用于细胞主体和从神经元细胞的神经突的级分的分离和 他们的RNA含量的表征。 图形摘要： ˚F神经元细胞的ractionation和亚细胞RNA内容分析 [背景技术在真核细胞中，蛋白质不对称分布以定义空间上专用的区域。在具有复杂的形态和/或大尺寸的细胞，像神经元，这种不对称通常更极端。这些扩展的形态要求有序的，有效的分选过程，以确保蛋白质正确定位。对于许多蛋白质，该过程通过将RNA分子转运到蛋白质功能位点而得以促进（E ngel等，202 0）。这些RNA的现场翻译产生立即被正确定位的蛋白质。在神经元中，这是一个普遍的过程，因为相对于它们的细胞体，这些细胞的投影中最多富集了1000种不同的RNA种类（Cajigas等，2012； Taliaferro等，2016）。 RNA定位被广泛用作基因表达的调节策略，并有助于一组不同的生物过程，包括交配-酵母型开关（贝特朗等人，发育模式中，1998年。）果蝇（埃弗吕西等人，1991; LECUYER等人（2007），以及肠道上皮细胞的养分响应（Moor等人，2017）。RNA定位的失调与一系列神经系统疾病（Wang等，2016）有关，包括脊髓性肌萎缩（Falini等，2011），肌萎缩性侧索硬化症（Chu等，2019; Briese等。 （2020）和脆弱X综合征（Dictenberg等，2008; Goering等，2020）。 尽管人们越来越认识到RNA本地化在促进一系列细胞功能中的作用，但仍有几个问题尚未解答。其中也许是最简单的问题存在一个小号方面荷兰国际集团RNA本地化：在给定的亚细胞定位存在哪些RNA和他们有什么相对丰度？为了回答这个问题，至少在神经元细胞的背景下，已经开发并应用了多种技术，包括激光捕获显微切割术（Zivraj等人，2010），分隔培养室（Gumy等人，2011），生长微流控设备（Nijssen et al 。，2018）和啮齿动物大脑的显微解剖（Cajigas et al 。，2012）。 在此协议中，我们描述了将神经元细胞分为神经突和细胞体部分的类似方法。该技术依赖于微孔培养膜。细胞在这些膜的顶部培养，其具有孔（通常是1-3微米直径）足够大，以允许突起通过它们传递到下侧，但足够小以保持细胞体在膜的顶部。上生长后的膜，可以将细胞机械地通过刮擦用细胞刮刀在膜的顶部，并除去脱落细胞体分馏。神经突仍然附着在膜的下面，可以裂解以提取RNA。以下RNA分离，所述级分的RNA含量能够通过反转录定量PCR（RT-qPCR的）或通过高被分析-可以通过RNA测序。 尽管此手稿的重点是神经元细胞的分离，但该方法也可以应用于多种细胞类型的细胞突起，包括成纤维细胞（Mili等人，2008）和迁移的癌细胞（Mardakheh等人，2015）。 ; Dermit等人，2020）。在神经元细胞的情况下，此程序已成功用于神经元细胞系（Taliaferro等人，2016 ；Goering等人，2020 ），原代小鼠皮层神经元（Taliaferro等人，2016）和iPS衍生神经元（Goering等，2020; Hudish等，2020）。它可能与大多数神经元细胞类型兼容。