A Sensitive Coupled Enzyme Assay for Measuring Kinase and ATPase Kinetics Using ADP-Specific Hexokinase
Ciaran McFarlane, James W. Murray
Abstract
Kinases and ATPases perform essential biological functions in metabolism and regulation. Activity of these enzymes is commonly measured by coupling ATP consumption to the synthesis of a detectable product. For most assay systems the ATP concentration during the reaction is unknown, compromising the precision of the assay.Using the ADP-specific hexokinase (ADP-HK) from the thermophilic archaeon Thermococcus litoralis the protocol outlined here allows real time coupling of ATP consumption to downstream signal change enabling accurate kinetic measurements. ADP-HK phosphorylates glucose that is then used by glucose-6-phosphate dehydrogenase to reduce NAD+ to NADH which can be measured at 340 nm. We have shown this assay to be sensitive to the detection of micromole quantities of ADP with no detectable background from ATP., [摘要 ] 激酶和ATPase 在代谢和调节中起着至关重要的生物学功能。通常通过将ATP的消耗与可检测产物的合成耦合来测量这些酶的活性。对于大多数测定系统，反应过程中ATP的浓度是未知的，从而降低了精密度。分析方法。 使用ADP特定己糖激酶（ADP-HK）来自嗜热古菌嗜热litoralis的议定书概述这里可以进行实时耦合ATP消费对下行信号变化进行高精度动态测量。ADP-HK磷酸葡萄糖这随后被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶可将NAD + 还原为NADH（可在340 nm处测定），已表明该测定法对检测ADP中的微摩尔量ADP敏感，没有可检测到ATP的背景。[背景 ] 激酶和ATP酶可通过将ADP的产生与分光光度法可检测的信号偶联来测量。商业供应商提供了试剂盒，用于检测通过将ADP产生的或ATP消耗掉与荧光或生物发光信号的产生进行检测的试剂盒（例如ATP） - 格洛; Promega公司，ADP-传感器; Biovision所属..）这些套件敏感，但很难适用于动力学问题，因为他们是终点分析，测量ADP金额在单个时间点。此外，黑匣子自然这种试剂盒因此很难确定反应混合物是否处于Michaelis-Menten 动力学所需的稳态条件下。 连续测定法可测量一段时间内的酶活性，可一次测定酶的速率，经典的连续偶联酶测定法是丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶系统（Kornberg和Pricer ，1951），在反应过程中，丙酮酸激酶使用了ADP。靶酶产生的酶将磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸，并在此过程中再生ATP。然后，乳酸脱氢酶将丙酮酸用于将NADH氧化为NAD + ，这是通过340 nm处吸光度的降低来测量的（图1A）。方法是连续再生ATP时，在任何给定点的ATP浓度都是未知的，这意味着无法计算ATP的Michaelis-Menten 动力学。 最佳偶联反应以线性途径进行，从而使产生的ADP按化学计量转换为产生信号的成分。利特尔热球菌的ADP特异性己糖激酶（ADP-HK）使用ADP将葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖，从而可以被6磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）用来将NAD + 还原为NADH（Ito 等人，2001; Sakuraba 和Ohshima，2002）（图1B）.ADP-HK是嗜热古细菌中一种ADP特异性酶，由于ADP比ATP具有更高的热稳定性，因此ADP-HK 可以消耗ADP而不是ATP.ADP-HK先前已与G6PDH和心肌黄递酶I 结合使用，可通过比色信号测量细胞提取物中dNDP 的丰度。可以在连续的动力学测定法中进行验证（Kumamagi et al。，2014）。在这里，我们利用ADP特异性己糖激酶的特异性来开发一种通过激酶和ATPases 检测ADP产生的方法。 C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ Proofreading_New提交系统\ 1903057 James Murray 839836 \ Figs jpg \ Fig1 .jpg图1.两种用于测量ATPase /激酶活性的偶联酶测定的示意图A. 传统的测量ATPase /激酶活性的方法是使用丙酮酸激酶将ADP产生与磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸然后再进行乳酸脱氢酶（LDH）的转化）将丙酮酸转化为乳酸-同时将NADH氧化为NAD + 导致340 nm处的吸光度降低.B。我们的替代方法是使用ADP-HK将ADP产生与葡萄糖的磷酸化偶联，然后由葡萄糖使用-磷酸脱氢酶-6（G6PDH）转换成葡萄糖-6-磷酸，以葡萄糖-6-磷酸- 其同时降低NAD Tasu 为了NADH由此而来340nm处的吸光度的增加。