Live-cell Imaging by Super-resolution Confocal Live Imaging Microscopy (SCLIM): Simultaneous Three-color and Four-dimensional Live Cell Imaging with High Space and Time Resolution
Kazuo Kurokawa, Akihiko Nakano
Abstract
Many questions in cell biology can be solved by state-of-the-art technology of live cell imaging. One good example is the mechanism of membrane traffic, in which small membrane carriers are rapidly moving around in the cytoplasm to deliver cargo proteins between organelles. For directly visualizing the events in membrane trafficking system, researchers have long awaited the technology that enables simultaneous multi-color and four-dimensional observation at high space and time resolution. Super-resolution microscopy methods, for example STED, PALM/STORM, and SIM, provide greater spatial resolution, however, these methods are not enough in temporal resolution. The super-resolution confocal live imaging microscopy (SCLIM) that we developed has now achieved the performance required. By using SCLIM, we have conducted high spatiotemporal visualization of secretory cargo together with early and late Golgi resident proteins tagged with three different fluorescence proteins. We have demonstrated that secretory cargo is indeed delivered within the Golgi by cisternal maturation. In addition, we have visualized details of secretory cargo trafficking in the Golgi, including formation of zones within a maturing cisterna, in which Golgi resident proteins are segregated, and movement of cargo between these zones. This protocol can be used for simultaneous three-color and four-dimensional observation of various phenomena in living cells, from yeast to higher plants and animals, at high spatiotemporal resolution., [摘要 ] 活细胞成像的最新技术可以解决细胞生物学中的许多问题。一个很好的例子是膜流量的机制，我n的小的膜载流子迅速在细胞质中四处移动到细胞器之间递送货物蛋白。为了直接可视化膜运输系统中的事件，研究人员期待已久的技术可以在高空间和时间分辨率下同时进行多色和多维观察。超分辨率显微镜方法（例如STED，PALM / STORM和SIM）提供了更高的空间分辨率，但是，这些方法在时间分辨率上还不够。 我们开发的超高分辨率共聚焦实时成像显微镜（SCLIM）现在已达到所需的性能。通过使用SCLIM，我们对分泌货物以及标记有三种不同荧光蛋白的早期和晚期高尔基体驻留蛋白进行了高时空可视化。我们已经证明，分泌的货物确实是通过胸骨成熟而在高尔基体内递送的。此外，我们已经可视化了高尔基地区分泌性货物运输的详细信息，包括在成熟的水箱内形成区域，隔离了高尔基驻留的蛋白质，以及这些区域之间的货物运输。该协议可用于以高时空分辨率同时进行从酵母到高等植物和动物的活细胞中各种现象的三色和四维观察。[背景 ] 的通过状态的最先进的光学显微镜活细胞成像发展极大地促进了残留在细胞生物学地址许多问题。例如，要可视化分泌途径中的事件，其中小的膜载体在细胞质中快速移动，则需要高速和三维（3D）图像采集。小号UPER分辨率共聚焦实时成像显微镜（SCLIM），我们开发（黑川等，2013） ，可以实现3D结构的动态特性高速可视化与空间分辨率超越活细胞标记有绿色和红色荧光蛋白光的衍射极限（Matsuura-Tokita 等，2006; Ito 等，2012; Okamoto 等，2012; Suda 等，2013; Uemura 等，2014; Kurokawa 等，2014; Iwai 等，2016； Ishii 等，2016 和2019 ； Kurokawa 等，2016）。现在，我们可以使用SCLIM的3色版本，这使我们能够以高空间和时间分辨率在活酵母，果蝇，植物和哺乳动物细胞中同时进行3色（绿色，红色和红外线）观察（Ito 等人；，2018； Kurokawa 等人，2019； Maeda 等人，2019； Tojima 等人，2019； Fujii 等人，2020）。我们一直在研究高尔基体中蛋白质转运和分选的分子机制，并利用我们技术的尖端性能解决了该领域的一个大问题。本文的目的是通过超分辨率和高速活细胞成像向读者介绍我们的方法，并提供基本协议。 高尔基体是膜运输的中心站。真核细胞中三分之一的蛋白质是在内质网（ER）中新合成的，然后传递到高尔基体中。在高尔基地区，它们经过加工和糖基化后再分拣到最终目的地（Emr 等，2009）。高尔基通常是有序的几个蓄水池的堆栈形式。分泌性货物从水箱的顺侧到反面，再到反高尔基网络（TGN），穿过堆叠体（Griffiths和Simons，1986）。芽殖酵母酿酒酵母礼物高尔基的一个独特的实施例，其中个别潴，顺，内侧和反式，不叠加，但分散在细胞质中（松浦-鸨田等人，2006;冈本。等人，2012） 。提出了高尔基体内的三种主要的货运货物运输模式：1）通过水母骨成熟运输，2）顺行水泡载体运输，以及3）相互关联的水箱连续性运输（Glick和Nakano，2009； Nakano和Luini，2010） ； Pfeffer，2010； Glick和Luini，2011）。在这些模型中，顺式内部成熟模型已被用来解释高尔基池在早期到晚期池中成熟的发芽酵母中的实时成像观察（Losev 等，2006； Matsuura-Tokita 等，2006； Rivera-Molina）。和Novick，2009年）和大型货物通过高尔基堆的运输而没有在哺乳动物中留下水箱（Bonfanti 等，1998； Lanoix 等，2001； Martinez-Menarguez 等，2001； Mironov 等，2001）。 ）。缺乏这种机制的证据是可视化正在成熟的高尔基蓄水池中剩余的货物的交付。 电子显微镜显示详细的捕捉信息，其中分泌性货物和高尔基体驻留蛋白位于单个高尔基水箱中，但不能直接可视化分泌性货物如何在这些水箱之间穿越。使用常规的落射和共聚焦荧光显微镜进行实时成像可以可视化体内分泌性货物的行为，但由于空间分辨率低，无法提供详细信息，其中分泌性货物和高尔基体驻留蛋白位于单个高尔基体池中。克服光的衍射极限的超分辨率显微镜方法，例如STED，PALM / STORM和SIM ，提供了更大的空间分辨率（Schermelleh 等，2010）。但是，这些方法的时间分辨率并不高，因为时间和空间分辨率通常会相互折衷。通过使用SCLIM技术，我们已经表明，分泌的货物是通过脑池成熟而在高尔基体内输送的。成熟的水箱涉及较早和较晚高尔基驻留蛋白的隔离区。在成熟过程中，货物的位置从水箱内的早期到晚期区域发生变化（Kurokawa 等，2019）。