Flow-cytometric Detection of Low-level Reactive Oxygen Species in Cell Lines and Primary Immune Cells

Abstract

Depending on its concentration and cellular origin the production of reactive oxygen species (ROS) in the organism serves a variety of functions. While high concentrations during an oxidative burst are used to fight pathogens, low to moderate amounts of ROS act as signaling molecules important for several physiological processes such as regulation of immune responses. The ROS-sensitive dye 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) is an inexpensive and well-established tool for measuring intracellular ROS levels. However, it needs to be carefully controlled to be able to draw firm conclusions on the nature of ROS species produced and the cellular source of ROS generation such as the enzyme complex NADPH-oxidase 2 (NOX-2). In this protocol, a robust method to determine low intracellular ROS production using H2DCFDA was validated by several ROS-specific as well as NOX-2-specific inhibitors. Cells were treated with inhibitors or control substances prior to treatment with the ROS-inducer of interest. H2DCFDA was added only for the last 30 min of the treatment schedule. To terminate its conversion, we used a ROS-specific inhibitor until analysis by flow cytometry within the FITC-channel (Ex: 488 nm/Em: 519 nm). In summary, this protocol allows the detection of signaling-relevant intracellular ROS production in cell lines and primary immune cells (e.g., Mono Mac 6 cells and Bone marrow-derived dendritic cells, respectively). Using this method in combination with specific inhibitors, we were able to validate even exceptionally low amounts of ROS produced by NOX-2 and relevant for immune-regulatory signaling., [摘要 ] 取决于其浓度和细胞来源，生物体中活性氧（ROS）的产生具有多种功能。虽然在氧化性爆发期间使用高浓度来对抗病原体，但低至中等量的ROS充当信号分子，对几种生理过程（例如免疫应答的调节）很重要。ROS敏感染料2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H 2 DCFDA）是一种用于测量细胞内ROS水平的廉价且行之有效的工具。但是，需要仔细控制它，以便能够对产生的ROS种类的性质和ROS产生的细胞来源（如酶复合物NADPH-氧化酶2（NOX-2））得出可靠的结论。在该协议中，使用H 2 DCFDA 确定低细胞内ROS产生的可靠方法已通过几种ROS特异性抑制剂和NOX-2特异性抑制剂的验证。在用感兴趣的ROS-诱导剂处理之前，用抑制剂或对照物质处理细胞。仅在治疗计划的最后30分钟内添加H 2 DCFDA。为了终止其转化，我们使用了ROS特异性抑制剂，直到通过FITC通道（例如：488 nm / Em ：519 nm）通过流式细胞仪进行分析。总之，该协议允许检测细胞系和原代免疫细胞（例如，分别为Mono Mac 6细胞和骨髓来源的树突状细胞）中与信号相关的细胞内ROS的产生。结合使用这种方法和特定的抑制剂，我们甚至能够验证NOX-2产生的与免疫调节信号相关的极少量的ROS。 [背景 ] 活性氧（ROS）可以在不同的细胞区室中产生，例如过氧化物酶体，细胞质，线粒体膜或质膜（Di Meo 等，2016）。高浓度的ROS会损害所有主要的细胞成分，因此对生命有机体是致命的威胁。在短时间内产生大量的ROS（通常称为氧化爆发）对于免疫系统抵抗病原体很重要。持续过量的ROS产生与多种疾病有关，例如类风湿性关节炎，糖尿病和神经退行性疾病。低浓度的超氧阴离子的（O 2 - ），以及它们，然而，已经描述了作为在细胞信号级联（必要调节衍生物Dröge ，2002）。质膜-结合的复合物的NADPH氧化酶2（NOX-2）是主要的一个ö 2 - 生产者吞噬细胞如树突状细胞，巨噬细胞和嗜中性粒。活性NOX - 2络合物由6个亚基（gp91phox，p22phox，Rac2，p40phox，p47phox和p67phox）形成，可以紧密调节NOX-2的活性。NOX-2可以同时生产，低电平和高电平的O- 2 - 被迅速转变为过氧化氢（H 2 ö 2 ; 贾尔迪诺等人，2017; Belambri 等人，2018）。H 2 O 2 相对稳定，并且负责细胞内和细胞外效应子功能。高量的NOX-2衍生的O 2 - 通过嗜中性粒细胞吞噬体中产生的是重要的，以杀死细菌通过直接氧化损伤。与此相反，H的低浓度的2 ö 2 履行必要帧内以及用于调节，细胞间第二信使功能例如，免疫应答（Bienert 等人，2006; Holmdahl 等人，2013年）。因此，H 2 O 2 被证明可以增强活化的T细胞中白介素2的表达（Roth和Dröge ，1987），并抑制吞噬细胞中促炎性细胞因子的分泌（Jendrysik 等，2011；Sareila 等）。 。，2011; 辛格运河和西格尔，2016;博德等人，2019）。因此，功能性NOX-2的丧失与免疫反应失调和几种自身免疫性疾病如红斑狼疮和克罗恩氏样炎症性肠病有关（Lee 等人，2011; O'Neill 等人，2016; Rosenzweig，2008 ；Singel 和Segal，2016年）。 已经建立了几种检测细胞中自由基产生的方案，这些方案使用发光素，鲁米诺，二甲酚橙或2'，7'-二氯二氢荧光素双乙酸盐（H 2 DCFDA）的化学发光作为检测细胞内ROS产生的工具（Gyllenhammar ，1987；Dahlgren和Karlsson，1999；Nourooz- Zadeh，1999）。H 2 DCFDA是研究细胞内氧化还原状态的最常用化学物质之一。还已经描述了用于测量H 2 O 2的其他灵敏和直接的方法，例如Amplex Red过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒（Karakuzu 等，2019）。但是，这种相对昂贵的工具可测量细胞外H 2 O 2 ，可能无法检测出少量的细胞内ROS。相比之下，与其他已建立的工具相比，H 2 DCFDA的重要优点是低成本，易于处理，灵敏度高以及可以在动力学方法中使用它。H 2 DCFDA通过扩散进入细胞，并转化为不可渗透的衍生物H 2 DCF，然后可被ROS 氧化为荧光2'，7'-二氯荧光素（DCF）。Eruslanov 和Kusmartsev 已发布了使用H 2 DCFDA 测量ROS的替代方案（Eruslanov 和Kusmartsev ，2010年）。值得注意的是，H 2 DCFDA缺乏特异性ö 2 - 基团，而是发生反应与几个ö 2 - / H 2 ö 2 转化的产品，如烷氧基，碳酸酯，过氧化氢，NO 2 - ，以及OH - 基团（Ischiropoulos 等人。，1999; Bilski案。等，2002; Eruslanov 和Kusmartsev ，2010）。此外，H 2 DCFDA易于通过例如曝光或通过凋亡期间释放的细胞色素c 的直接或间接氧化来介导的人工转化（Kalyanaraman 等人，2012）。因此，必须小心控制H 2 DCFDA 对ROS的检测，以确认细胞依赖性ROS的产生以及诸如NOX - 2 之类的起源酶（Bilski 等，2002； Ohashi 等，2002；Eruslanov 和Kusmartsev ，2010）。为了进一步指定被测ROS的来源和种类，使用了不同的ROS特异性抑制剂（6-Hydroxy-2,5,7,8 -tetramethylchroman-2-羧酸; Trolox，N-乙酰半胱氨酸; NAC和强烈建议使用过氧化氢酶以及NOX -2特异性抑制剂（sgp91 ds- tat 和GSK2795039）。 以下方案包括使用特定的抑制剂，以使鲁棒检测在细胞系（的Mono Mac 6（MM6）细胞，低ROS水平的的Jurkat T细胞，等等）和初级免疫细胞（骨髓来源的树突细胞，等。）。除了使用抑制剂进行预处理以区分感兴趣的ROS诱导剂介导的来源和物种（参见表1）之外，还使用了一般的ROS清道夫Trolox或NAC来终止H 2 DCF与DCF 的反应。实验治疗结束。后者确保仅测量在实验环境中产生的ROS，并防止与处理无关的有害转化，例如洗涤过程中的应力响应和最终测量。通过使用该协议，可以以信号相关的浓度高度可重复地检测细胞内ROS的产生（Bode 等人，2019）。

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