Multitarget Immunohistochemistry for Confocal and Super-resolution Imaging of Plant Cell Wall Polysaccharides
Kalina T. Haas, Methieu Rivière, Raymond Wightman, Alexis Peaucelle
Abstract
The plant cell wall (PCW) is a pecto-cellulosic extracellular matrix that envelopes the plant cell. By integrating extra-and intra-cellular cues, PCW mediates a plethora of essential physiological functions. Notably, it permits controlled and oriented tissue growth by tuning its local mechano-chemical properties. To refine our knowledge of these essential properties of PCW, we need an appropriate tool for the accurate observation of the native (in muro) structure of the cell wall components. The label-free techniques, such as AFM, EM, FTIR, and Raman microscopy, are used; however, they either do not have the chemical or spatial resolution. Immunolabeling with electron microscopy allows observation of the cell wall nanostructure, however, it is mostly limited to single and, less frequently, multiple labeling. Immunohistochemistry (IHC) is a versatile tool to analyze the distribution and localization of multiple biomolecules in the tissue. The subcellular resolution of chemical changes in the cell wall component can be observed with standard diffraction-limited optical microscopy. Furthermore, novel chemical imaging tools such as multicolor 3D dSTORM (Three-dimensional, direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) nanoscopy makes it possible to resolve the native structure of the cell wall polymers with nanometer precision and in three dimensions.Here we present a protocol for preparing multi-target immunostaining of the PCW components taking as example Arabidopsis thaliana, Star fruit (Averrhoa carambola), and Maize thin tissue sections. This protocol is compatible with the standard confocal microscope, dSTORM nanoscope, and can also be implemented for other optical nanoscopy such as STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy). The protocol can be adapted for any other subcellular compartments, plasma membrane, cytoplasmic, and intracellular organelles., [摘要]所述的植物细胞壁（PCW）是pecto该信封-cellulosic细胞外基质Ë S中的植物细胞。通过整合外和内-细胞线索，PCW介导的基本的生理功能太多了。值得注意的是，它可以通过调节其局部机械化学特性来控制组织的生长。为了完善我们的PCW的这些基本性能的了解，我们需要为本地（准确观察一个合适的工具在穆罗的细胞壁组分）的结构。使用无标记技术，例如AFM，EM，FTIR和nd拉曼显微镜。但是，它们没有化学或空间分辨率。免疫标记随e lectron米icroscopy允许细胞壁纳米结构的观测，但是，它主要局限于单一和，较不频繁地，多重标记。我免疫组织化学（IHC）是分析低压配电设计的多功能工具在组织重刑和多种生物分子的定位。可以用标准的衍射极限光学显微镜观察细胞壁成分化学变化的亚细胞分辨率。此外，新颖的化学成像工具（例如多色3D dSTORM （三维直接随机光学重建显微镜）纳米显微镜）可以以纳米精度和三维精度解析细胞壁聚合物的天然结构。这里，我们提出用于制备以与实施例的PCW组分的多目标免疫染色的协议拟南芥吨haliana ，杨桃（阳桃），和玉米薄的组织切片。该协议与标准共聚焦显微镜dSTORM纳米镜兼容，也可以用于其他光学纳米镜，例如STED（受激发射损耗显微镜）。该方案可适用于任何其他亚细胞区室，质膜，细胞质和细胞内细胞器。[背景] PCW是一个复杂的材料，其是硬脑膜BLE但也经历响应于内部和外部刺激如组织膨胀或病原体攻击恒定结构变化。然而，这些看似矛盾的特征，机械强度和结构适应性如何协同作用，仍然是植物细胞生物学中尚未解决的问题。PCW包含纤维素，半纤维素，果胶的不同变体和各种蛋白质，其结构高度组织化（Peaucelle，2018）。果胶家族由几种聚合物组成。Ť他最为丰富，homogalacturonan，可细胞壁插入后脱甲基化。这种化学变化是细胞伸长，分化和定向生长过程中的重要一步（Peaucelle等，2012）。有几条证据表明，形态发生和细胞分化取决于细胞壁化学和细胞壁聚合物组织的局部变化（Yang等人，2016; Anane等人，2017; Zhao等人，2019; Haas等人。（2020年）。因此，对PCW组件架构的详细了解对于理解植物生长至关重要。从历史上看，已经使用生化方法研究了细胞壁的结构，包括分解组织并破坏其聚合物的天然组织（Höfteand Voxeur，2017）。其他成像模态，诸如电子米icroscopy （EM） （安恩等人，2017）和原子力显微镜（AFM） （张等人，2017）被用于原位细胞壁观察，但是这些技术往往缺乏化学相反，仅提供相关的量化。多色免疫组织化学（IHC）可以揭示组织切片内的多个靶标，并将它们的空间组织分解为三个维度。尽管它在细胞生物学领域得到了广泛的应用，但多色IHC仍不是研究细胞壁的标准工具。针对细胞壁靶标的抗体和探针种类繁多，再加上多色IHC，以及dSTORM （ 所述dSTORM允许与在5-10nm精度生物分子的定位; 但是，最终dSTORM分辨率通常在40 nm左右，受限于抗体复合物的大小（约15-30 nm）。免疫金电子显微镜（iEM ）也可与ICH结合使用，以高分辨率研究细胞结构。IEM是堪比dSTORM分辨率，并且还通过抗体复合物的限制大小。纳米金颗粒的大小决定了iEM的对比度和分辨率；> 1 nm的金纳米颗粒可用；然而，如此小的颗粒限制了对比度，并且经常使用较大的颗粒。与dSTORM相比，IEM具有几个其他缺点：（1）用蛋白A（或G）金络合物探测的一抗不穿透树脂包埋的样品，仅识别表面表位，尽管是连续和超薄的低温切片技术可以解决这个问题（50 nm，-120 °C [ Slot，1989 ] ）；（2）样品大多是单标签的；然而，通过使用不同的纳米颗粒大小，可以标记两个或三个表位，但这需要超薄冷冻切片技术的技术经验（Slot和Geuze，2007）。（3）IEM的标记和检测效率低（比dSTORM低3-5个数量级（Majda等，2017; Haas等，2020）），这也与以下事实有关，即仅表面抗原决定簇是因此，多色3D dST ORM纳米技术可以提供超越以前的技术应用范围的对细胞壁多糖天然结构纳米结构的空前见识，DSTORM可以对细胞进行三维（3D）定量纳米成像和组织（Heilemann等，2008;黄等，2008;范·德林德等。，2011; Sydor 。等人，2015年，徐等人，2018） 。主要适用于蜂窝系统，它推出了新的蛋白质的结构组织，例如突触纳米域，反突触纳米柱，DNA重组酶纳米丝，核被膜孔结构，细胞骨架，线粒体，粘附复合物和染色质转录景观（Shroff等，2008； Shim等，2012） ;Löschberger等。，2012；Jakobs和Wurm，2014年；Prakash等。，2015；Boettiger等。，2016；Sellés等。，2017; Dlasková等。，2018; 哈斯等。，2018 a和2018 b ; Pan等。，2018; 夏等。，2019; Chen等。，2020; Wäldchen等。（2020年）。然而，由于需要组织水平成像的单细胞模型系统的局限性，几乎没有在植物科学中使用它（Liesche等人，2013； Komis等人，2015； Haas等人，2020）。在这里，我们介绍了与植物薄组织切片上的标准共聚焦显微镜和dSTORM纳米镜兼容的样品制备的详细协议。