ATAC-Seq-based Identification of Extrachromosomal Circular DNA in Mammalian Cells and Its Validation Using Inverse PCR and FISH

Abstract

Recent studies from multiple labs including ours have demonstrated the importance of extrachromosomal circular DNA (eccDNA) from yeast to humans (Shibata et al., 2012; Dillon et al., 2015; Møller et al., 2016; Kumar et al., 2017; Turner et al., 2017; Kim et al., 2020). More recently, it has been found that cancer cells obtain a selective advantage by amplifying oncogenes on eccDNA, which drives genomic instability (Wu et al., 2019; Kim et al., 2020). Previously, we have purified circular DNA and enriched the population using rolling circle amplification followed by high-throughput sequencing for the identification of eccDNA based on the unique junctional sequence. However, eccDNA identification by rolling circle amplification is biased toward small circles. Here, we report a rolling circle-independent method to detect eccDNA in human cancer cells. We demonstrate a sensitive and robust step-by-step workflow for finding novel eccDNAs using ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) combined with a Circle_finder bioinformatics algorithm to predict the eccDNAs, followed by its validation using two independent methods, inverse PCR and metaphase FISH (Fluorescence in situ Hybridization)., [摘要]包括我们在内的多个实验室的最新研究已经证明了酵母染色体外循环DNA（eccDNA）对人类的重要性（Shibata等人，2012；Dillon等人，2015年；米øLeller等人，2016年；Kumar等人，2017年；Turner等人，2017年；Kim等人，2020年）。最近，发现癌细胞通过扩增eccDNA上的癌基因获得选择性优势，从而导致基因组不稳定（Wu等人，2019；Kim等人，2020年）。以前，我们已经纯化了环状DNA，并利用滚动圈扩增和高通量测序来富集群体，用于基于独特连接序列的eccDNA鉴定。然而，用滚圈扩增法鉴定eccDNA的方法偏重于小圆。在这里，我们报道了一种检测人类癌细胞eccDNA的非滚动圆方法。我们展示了一个敏感而稳健的一步一步的工作流程，使用ATAC-seq（转座酶可访问染色质测序分析）结合Circle-finder生物信息学算法预测ECCDNA，然后使用两种独立的方法进行验证，反向PCR和中期FISH（荧光原位杂交）。[背景]染色体外环状DNA（eccdna）是一种独特的DNA分子，除了携带染色体DNA外，还携带遗传信息。从酵母到人类的不同生物体中都发现了这些eccdna（Shibata等人，2012；Dillon等人，2015年；米øLeller等人，2016年；Kumar等人，2017年；Turner等人，2017年；Kim等人，2020年）。eccdna的长度范围很小（小于1kb，也称为微DNA）到大（兆碱基长）。虽然具有微同源末端的小eccdna可能促进遗传异质性（Shibata等人，2012）或在转录后产生短rna（Paulsen等人，2019），但长eccdna可能含有完整的基因和调控元件，如增强子（Morton等人，2019；Wu等人，2019年；Koche等人，2020年）。新的证据表明，eccdna可能在调节基因表达和基因组不稳定性方面发挥未被充分认识的作用，这最终有助于细胞的选择性优势（Gresham等人，2010年，Koo等人，2018年；赫尔等人，2019年）。特别是，携带癌基因的eccdna在人类癌症中高度扩增，除了与不良预后相关外，还与染色质开放、癌基因表达增加和染色体结构重排相关（Wu等人，2019；Kim等人，2020年；Koche等人，2020年）。发现循环中的eccdna也使其成为诊断目的的预期靶点（Kumar等人，2017；Sin等人，2020年）。随着对eccDNA研究的不断深入，eccDNA发现工具的开发势在必行。历史上，通过核型分析、电子显微镜、Southern印迹和2-D凝胶电泳检测到不同大小的eccdna（见Paulsen et al.，2018）。最近，各种高通量测序（HTS）技术被用来促进新的ECCDNA的发现（Shibata等人，2012；米øLeller等人，2015年；Kim等人，2020年）。通过HTS方法检测eccDNA的基本思想是基于其独特的循环特征——从成对末端读取可以识别出高置信度的eccDNA，即（1）不能在线性基因组上映射为内向对，以及（2）包含表示染色体断裂/连接点的独特循环连接序列。正常参考基因组中不存在的独特连接序列（如图1A中的“E-A”）可以通过连接线性DNA的两端形成，从而形成环状DNA。然而，大多数eccDNA测序管道采用多重置换扩增（MDA）技术，这是一种通过滚圈扩增法扩增少量DNA的有效方法，它优先扩增短圈。因此，我们试图开发一个独立于MDA的管道，其中包含了一些额外的验证分析。最近，我们展示了一个从人类癌细胞培养物中检测和验证新eccdna的强大工作流程（Kumar等人，2020）。具体而言，ATAC-seq（转座酶可及染色质测序分析）和Circle-finder算法被用于新的eccDNA预测。ATAC-seq于2013年首次开发，利用工程化的Tn5转座酶切割染色质区域（包括染色质较少的eccdna）和插入转座酶相关的适配器dna（Buenrostro等人，2013和2015）。Circle finder算法（指用于链接访问的软件）通过成对末端测序预测eccdna，其依据是：（1）存在分裂读取（一个读取映射到基因组中的两个位点）(2） 分裂后的两个片段在同一条染色体和同一条链上读取图谱；以及（3）分割读取上的两个片段之间的连续读取映射和分割读取上的相反链上的连续读取映射。预测的eccdna可以通过两个独立的验证分析进行评估（图1）。反向PCR（图1B）将用一对横跨独特连接序列的引物（如“E-a”）特异性地扩增eccdna；这样的一对引物面向基因组DNA，不会导致扩增。或者，中期FISH可以直观地确认eccDNA（图1C），它可以检测与主染色体重叠的基因组DNA信号和与染色体不重叠的eccDNA信号。 图1。ATAC-seq、反向PCR和中期FISH在eccDNA鉴定和验证中的应用

Topics & Concepts