High Throughput Analyses of Ascorbate-turnover Enzyme Activities in Rice (Oryza sativa L.) Seedlings
Lin‐Bo Wu, Yanru Feng, Frederike Zeibig, Muhammad Shahedul Alam, Michael Frei
Abstract
Ascorbate (Vitamin C) fulfills various functions in plant photosynthesis and abiotic stress tolerance. The four key enzymes involved in the ascorbate-turnover pathway are ascorbate peroxidase, ascorbate oxidase, monodehydroascorbate reductase, and dehydroascorbate reductase. Several reports have shown the pivotal roles of these enzymes in plant development and stress tolerance. Therefore, reliable and rapid assay protocols are required for researchers to investigate their enzymatic activities during plant development and stress responses. Previously published methods for analyzing these enzymatic activities rely on cuvette spectrophotometers, which can only handle one sample per test, leading to a prolonged investigation. In this protocol, we employed a 96-well microplate reader to analyze at least eight samples with two technical replicates simultaneously. We analyzed two rice (Oryza sativa L.) genotypes with distinct ascorbate oxidase and dehydroascorbate reductase activities to demonstrate the assay process, including plant growth, sample preparation, reaction setup, and data analysis. Our protocol provides a high throughput method for investigating ascorbate turnover-related enzymatic activities in plants., [抽象的] 抗坏血酸（维生素 C）在植物光合作用和非生物胁迫耐受性方面具有多种功能。参与抗坏血酸转换途径的四种关键酶是抗坏血酸过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、单脱氢抗坏血酸还原酶和脱氢抗坏血酸还原酶。一些报告显示了这些酶在植物发育和胁迫耐受性中的关键作用。因此，研究人员需要可靠和快速的检测方案来研究它们在植物发育和应激反应过程中的酶活性。以前发表的分析这些酶活性的方法依赖于比色皿分光光度计，每次测试只能处理一个样品，导致调查时间延长。在该协议中，我们采用了 96 孔酶标仪同时分析了至少 8 个样本，同时进行了两次技术复制。我们分析了两种大米（Oryza sativa L.) 具有不同抗坏血酸氧化酶和脱氢抗坏血酸还原酶活性的基因型，以证明检测过程，包括植物生长、样品制备、反应设置和数据分析。我们的协议提供了一种高通量方法来研究植物中与抗坏血酸周转相关的酶活性。 [背景] L-抗坏血酸（AsA，维生素 C）是最丰富的水溶性抗氧化剂，参与植物光合作用、激素生物合成和非生物胁迫耐受性（Gallie，2012）。在光合作用中，AsA 通过抗坏血酸过氧化物酶 (APX, EC 1.11.1.11) 作为光合电子载体的氧化还原状态调节剂 (Smirnoff and Wheeler, 2000)。抗坏血酸氧化酶 (AO, EC 1.10.3.3) 催化 AsA 氧化为单脱氢抗坏血酸 (MDHA)，然后进一步歧化为脱氢抗坏血酸 (DHA) 和 AsA。MDHA 和 DHA 可以分别通过单脱氢抗坏血酸还原酶 (MDHAR, EC 1.6.5.4) 和脱氢抗坏血酸还原酶 (DHAR, EC 1.8.5.1) 再循环成 AsA（图 1）。AsA 的周转在植物的非生物胁迫耐受性中起着至关重要的作用。在甘薯（Ipomoea batatas ）中过度表达 APX 基因赋予了对盐、氧化和寒冷胁迫的耐受性（Lim等，2007；Yan等，2016）。类似地，在番茄植物中过表达 MDHAR 基因会增加对低温胁迫的耐受性（Stevens等，2008）。此外，约翰斯顿等人。(2015) 确定了植物 MDHAR 在介导 2,4,6-三硝基甲苯 (TNT) 毒性中的作用。吴等人。(2017) 报道，水稻的铁毒性耐受性与较高的 AO 活性和较低的 DHAR 活性有关。由于植物发育和胁迫耐受性的关键相关性，需要可靠和快速的检测方案来研究这些 AsA 转换酶在各种条件下在植物中的作用。Pignocchi等人报道了烟草 ( Nicotiana tabacum L.) 中的 AO 活性测定。(2003) 使用分光光度法监测 AsA 氧化速率，由 265 nm 处吸光度的降低表示。对于 APX 活性测定，Das等人。(2015)通过使用分光光度计分析 290 nm 处的吸光度，测量了 H 2 O 2介导的 AsA 氧化。菠菜中的 MDHAR 活性由 Hossain等人确定。(1984)，他们通过监测 340 nm 处吸光度的降低来测量 NADH 的氧化。对于 DHAR 活性测定，Stahl等人。(1983) 报道了使用分光光度法检查 AsA 生成的协议。这些协议通常使用分光光度计和比色皿来监测特定波长下的吸光度变化，每次运行仅测量一个样品，导致调查时间延长。为了克服先前报告的协议中低吞吐量的限制，我们开发了一种基于微孔板读取器的方法，能够在一次测试中测量超过 8 个具有技术重复的样本。我们的协议也可以适用于调查其他植物物种中与抗坏血酸周转相关的酶。 图 1. 抗坏血酸-周转途径和抗坏血酸-谷胱甘肽循环。在叶绿体中，SOD 清除PSII 中产生的O 2 -以形成 O 2和 H 2 O 2分子。APX以 AsA 作为电子供体介导 H 2 O 2的清除，导致 MDHA 的产生。MDHA 也是通过 AO 介导的 AsA 氧化产生的。MDHA 进一步涉及两个不同的过程：(i) 以 NADH 作为电子供体通过 MDHAR 还原回 AsA，以及 (ii) 解离生成 DHA。DHAR 以两分子 GSH 作为电子供体介导 DHA 还原为 AsA。GR 以 NADPH 作为电子供体调节 GSSG 向 GSH 的还原。O 2 - ，超氧化物；SOD，超氧化物歧化酶；H 2 O 2 ，过氧化氢；APX，抗坏血酸过氧化物酶；AsA，抗坏血酸/抗坏血酸盐；AO，抗坏血酸氧化酶；MDHA，单脱氢抗坏血酸盐；MDHAR，单脱氢抗坏血酸还原酶；NADH/NAD + ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；DHA，脱氢抗坏血酸；DHAR，脱氢抗坏血酸还原酶；GSH，谷胱甘肽；GSSG，二硫化谷胱甘肽；GR，谷胱甘肽还原酶；NADPH/NADP + ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。