Auxin-mediated Protein Degradation in Caenorhabditis elegans
Michael A. Q. Martinez, David Q. Matus
Abstract
The auxin-inducible degron (AID) technology was recently adapted for use in the nematode Caenorhabditis elegans. Rapid degradation of C. elegans proteins tagged with an AID is mediated by a plant-specific F-box protein, transport inhibitor response 1 (TIR1), and occurs only in the presence of the phytohormone auxin. The first iteration of this technology elicited protein degradation in C. elegans through a naturally occurring form of auxin, indole-3-acetic acid (IAA). Here, we present a protocol that uses 1-naphthaleneacetic acid, potassium salt (K-NAA), an indole-free synthetic auxin analog. At equal concentration, K-NAA is as effective as IAA in standard nematode growth media (NGM). K-NAA is also effective in physiological buffer (M9), allowing for high-throughput experimentation. The main advantages of K-NAA are twofold: first, its photostability prevents light-induced compound degradation during storage and the production of toxic indole-derivatives during fluorescence microscopy of live cells; and second, its water solubility eliminates the need of using ethanol to dissolve the auxin compound, a solvent that may confound C. elegans lifespan and behavioral assays. In this protocol, we describe our method of degrading C. elegans proteins using K-NAA on solid and in liquid media, as well as our method of analyzing protein degradation., [摘要 ] 植物生长素诱导的德隆（AID）技术最近被用于线虫秀丽隐杆线虫。带有AID标签的秀丽隐杆线虫蛋白的快速降解是由植物特异性F-box蛋白介导的，转运抑制剂反应1 （TIR1），而且只发生在存在的植物激素生长素。第一次迭代的这项技术引起蛋白质降解C. 线虫通过一个天然存在形式的生长素，吲哚-3-乙酸（IAA）。在此，我们协议用途1-萘乙酸，钾盐（K-NAA），一个，自由吲哚合成的植物生长素类似物。在相等浓度 ，K-NAA在标准线虫生长培养基（NGM）中与IAA一样有效。K-NAA在生理缓冲液（M9）中也有效，可以进行高通量实验。K-NAA的主要优点有两个：它的光稳定性可防止光诱导的化合物在储存过程中降解以及在活细胞的荧光显微镜检查过程中产生有毒的吲哚衍生物;其次，其水溶性消除了使用乙醇溶解植物生长素化合物（一种可能混淆C 的溶剂）的需要。线虫寿命和行为分析。在这个协议中，我们描述方法降解菌的C. elegans的使用K-NAA对固体和液体介质的蛋白质，以及我们的方法分析蛋白质降解。[背景 ] 有条件的蛋白质降解通过降解决定子是一个新兴的方法研究蛋白质功能在秀丽隐杆线虫（拔头筹而Frokjaer -詹森2019年）。现在的降解决定子的方法包括ZF1 （Armenti 等人。2014年，萨累。等，2018） ，生长素诱导型德龙（AID）（Zhang 等人，2015; Martinez 等人，2019），以及GFP 纳米抗体介导的蛋白质降解（Wang 等人，2017）。最初，选择了基于生长素的德龙方法植物和移植自进入非植物系统，如酵母，鸡和哺乳动物细胞培养（西村等，2009） 。这种方法最近优化适用于在C. 线虫由于进展CRISPR / Cas9基因编辑技术（张的Et人，2015; Dickinson公司和戈尔茨坦，2016 ）。在钍Ë驻留的植物激素生长素，C. 线虫蛋白质标记有AID快速降解由到的异源表达的植物，特异的F-box蛋白，转运抑制剂响应1（ TIR1）。TIR1充当底物识别 基于CUL-1的SCF E3泛素连接酶复合物的离子成分由SKR-1 / 2，CUL-1和RING成分RBX-1组成（Martinez 等人，2019）。仅需30分钟，C。暴露于生长素的线虫蛋白可以以组织和细胞特异性方式精确降解（Zhang et al。，2015; Martinez et al。，2019）。 无论是天然植物生长素吲哚-3-乙酸（IAA）或合成生长素1-萘乙酸（NAA）可用于Ç Onditionally消耗靶蛋白（张等人，2015年，马丁内斯等人，2019） 。但是NAA具有优于IAA的优势，部分原因是它具有光稳定性（Yamakawa 等，1979）。用于激发GFP的蓝光与IAA的结合已被证明分别导致酵母和哺乳动物卵母细胞的有丝分裂和减数分裂缺陷。（Papagiannakis et al。，2017; Camlin and Evans，2019）。这种作用可能是通过IAA对其有毒的吲哚衍生物进行光解而发生的（Folkes and Wardman，2001; Srivastava，2002）.ext，NAA的钾盐。 （K-NAA）具有额外的优势作为完全溶于水。这就避免N个EED揭批C. elegans的要低百分比乙醇，用来溶解IAA，或其他可能有害的溶剂（李等人，2019）此外，与4 mM IAA 相比，K的等效浓度 不影响-NAA生长C. 杆线虫的细菌食品大肠杆菌OP50 （Martinez的等，2019） 。此外，4 MM IAA导致显着的胚胎致死性相比K-NAA相同浓度（Martinez的等，2019 ）。该协议的潜在应用包括使用微流控设备或将蠕虫浸入K-NAA的96孔板进行的高通量，高分辨率化学遗传筛选。此处介绍的协议将在C 的简单过程中详述。将线虫幼虫浸入在斑点板上的M9生理缓冲液中稀释的K-NAA中，或暴露于在传统线虫生长培养基（NGM）中稀释的K-NAA中，最后，逐步进行定量蛋白质降解程度的步骤是提出。